因為(wéi)對孔徑的共同(tóng)的安置,共聚集顯微鏡(jìng)勘(kān)探器所供給的圖畫對應於一個薄的光學切片或是(shì)樣品的截麵。例如,一個幾毫米厚的樣品(pǐn)在焦平麵處沿z軸降最少於微米。

共聚集處的光照場通過一(yī)個被稱為針孔的孔(kǒng)徑所約束。視場相同也遭到一個針孔的約束,針孔的方(fāng)位是相關於第一個孔徑與照耀點(diǎn)共軛的像平麵上。這種共聚集裝備(bèi)的成果即(jí)是降低了對散焦光的勘探,然後通過削減成像容積來添加(jiā)信噪比。

Marvin Minsky首要規劃了共聚集顯微鏡(jìng)並在1957年的一份專利中描繪了一(yī)個通過移動照耀光束渠道來(lái)完成的(de)。從樣品發來的(de)調製光被送往光電管用示波器調查。光照耀及隨後的勘探是通逐點地過移動渠道來完成的(de)。Minsky的(de)極具自創性的設想終究徹底改變了顯微鏡。

Minsky的專利被通過的時分,仍是存在有幾個技能難(nán)點。因為約束(shù)孔徑,他的體係需求非常強的光源。鑒於由(yóu)針孔損失的光強,在其時(shí)激光並不存在,而且也沒有別的滿(mǎn)足強的光源來激起熒光。在那時分Minsky運(yùn)用(yòng)的(de)是長期耐久的示(shì)波器做觀測,因(yīn)而(ér)沒有辦法照實記(jì)載圖畫。致使(shǐ)別的發明者對這一(yī)特別的顯微鏡做進一步的發展(zhǎn)變成對一般研究者的有(yǒu)用東西。

發展激烈的(de)單色光源—激光—處理了照(zhào)耀的疑(yí)問。計算機(jī)裝備(bèi)了數字化儀以後,使記載和實踐圖畫變得(dé)垂手可(kě)得。如今,如今掃描共焦運用激光或結合激光作為照耀光源。這種掃描是通過(guò)精確操控振鏡以光柵運動的方(fāng)法,用最小光(guāng)斑掃過視場,就像通過電腦操控電視相同(tóng)。從樣品散射或反射(shè)的熒(yíng)光信號被發送到(dào)光(guāng)電倍增管(PMT),這是一次構成圖畫在屏幕上的一個點(像元素、像素點)。

盡管Minsky羅列了共聚集的很多長處,或許(xǔ)最(zuì)主要的功(gōng)用(yòng)即是掃描共(gòng)聚集顯微鏡能夠對樣品進行光學截(jié)麵成像。傳統上,通過固定安(ān)排(pái)然(rán)後細心地將其切片成以(yǐ)便調查和成像的薄層,來獲取細胞或安排的精細結構。這個進程需求將樣品處死,而且(qiě)需求研究人員花費好幾年(nián)時刻去(qù)學習切片技(jì)能才能將樣品切(qiē)割到成像所需的滿足薄的(de)厚度。

共聚(jù)集的(de)光學(xué)切片功能答應用戶對厚安排成像而不需(xū)求特(tè)別的切(qiē)片(piàn)竅門。它還答(dá)應用戶對活的細胞、安排以及(jí)生物體進(jìn)行超高分辨率成像。活體細胞成像(xiàng)現已變成共焦顯微鏡的一個主要組(zǔ)成部(bù)分。

這種光學切片的才能也意味著單張切片/圖畫能夠保存到計算機,然後還能夠將圖畫重組為樣品的三維圖畫。這(zhè)在(zài)現有的(de)激光掃(sǎo)描體(tǐ)係中是(shì)非常(cháng)主(zhǔ)要的特(tè)征。
此體係在熒光成像中會選用一(yī)些特別的光學元件。一個多見的誤解以為激光器發生的激光輸出隻有一個波長。實踐上簡直一切的激(jī)光器都將發生諧波或散(sàn)射別的(de)波長光。盡管這(zhè)些次波段的(de)光跟主波段比較強(qiáng)度很弱,但是他(tā)們仍是能夠大大降低信噪比。假如熒光的發射波段恰好落在激光(guāng)諧波的(de)規模內(或是來自激光的別的雜光),那麽(me)熒光信(xìn)號可能會徹底被掩(yǎn)蓋(gài)掉而勘探不到。
光(guāng)路中的首要器件即是激光純化濾波片,這即是經(jīng)修飾過的激(jī)起光濾波片。因(yīn)為(wéi)激光的相幹性和相對較小的光束以及光路準直的請求,這些鏡片都是要通過研磨和拋光處理的。這(zhè)就與寬場顯(xiǎn)微鏡構成明顯的對(duì)比,因為寬場顯(xiǎn)微鏡不需求研磨和拋光。純化鏡片還應具有極好的傳輸特性,包括波前畸變要少(shǎo)於每英寸一個波長。違背角(jiǎo)(與鏡片外緣理想平行線(xiàn)的偏差)應盡量減小到小於一個弧度角分,這麽在同一個體係中運用(yòng)不一樣純(chún)化濾波片的時分就(jiù)不用從頭糾正了。
一個純化濾波片的(de)半波寬度(FWHM)通(tōng)常是在(zài)10nm左右(yòu)。它會(huì)堵塞激光(guāng)光(guāng)源的別的雜光(最大規(guī)模會從紫外光到1200nm)和(hé)減(jiǎn)反射(shè)塗層來到達最大傳輸。
跟著更新、更強的激光器(qì)的呈現,運用增透膜來添加透過率就顯得沒有必要了。但是(shì),這些光學器件選(xuǎn)用最大(dà)反(fǎn)射的幹涉塗層以防止(zhǐ)熱損(sǔn)害,增(zēng)透膜將因而削減表麵(miàn)反射。這些(xiē)反射光不能被反射進入激(jī)光器的共振腔。因而,這些光件被規劃用於入射角(AOI)在3.5度到5度之間。二極管激光器在熱身以後所發射的光的波長會有輕微的變化,因而,我們主張為這些光源裝備20-25nm寬(kuān)的純化濾波片。在共聚集體係和一般熒光顯微體係中,為了獲(huò)得較好的平麵平整度,它(tā)們有必要克(kè)服(fú)波前像差。盡管兩種體係的波前像差都操控在每英寸一個波的規模(mó)內(nèi),但在共聚集(jí)體係中挑選二向色鏡明顯能夠獲得更好的作用。
現在,要4-6m厚的熔融石英基(jī)片上完成二向色性現已很多見了,但不斷增加的需求需求用更厚的(de)基片(piàn)來消除波前像差並(bìng)完成二向色性。
在過去幾年時刻裏,跟著激光器的規模做得越來越(yuè)大,也會(huì)有這些越來越大的功率負載(zǎi)可能會摧毀主鏡方麵的擔心。這(zhè)關於規劃傑出的二向(xiàng)色鏡來說不成疑問,對多見大小的光束負載最少到達8-10瓦特的功率。通過增透膜來最(zuì)大極限的減小(xiǎo)聚束光的反射使透射率最大化。
偏振也是濾(lǜ)鏡要思考的另一個因素。因為一切的光件對光路有偏轉視點時都能夠充任(rèn)偏振鏡,這對大多數偏振激光來說就(jiù)顯得尤為主要。
一切熒光發射濾鏡的主要作用即是阻撓激起光的透過。比(bǐ)較(jiào)較於熒光顯微鏡而言,關於共(gòng)聚集體係,這種堵塞並(bìng)不包括很寬的光譜規模。但是,因為激光束的高功率輸出,需求對激光發射的特定波長專門規(guī)劃更大的堵塞(sāi)(或許高於OD 8)。
對共聚集體係(xì)發射濾(lǜ)鏡的實踐規劃仍是存在一些爭議。因為大多數勘探器(qì)選(xuǎn)用光電倍增管(PMT),圖畫一次采集隻構成一個像素(圖畫元素(sù)),這些濾鏡光件就不需求打磨(mó)和拋光。但因為共聚集成像對分辨(biàn)率的請求越來越高,就像別的發射濾波片相同通過打磨和拋光並不是在糟蹋精力。近期一(yī)些(xiē)依據標明,發射濾波片具有較大(dà)楔形時(光束變差)可能會形成(chéng)形態學(xué)丈(zhàng)量的不精確,這種不精確在長(zhǎng)發射光(guāng)路中可能會更嚴峻。
激光體(tǐ)係的濾波片光具座是環繞激光發射而規劃的,並不一定對於特(tè)定熒(yíng)光染料的最大或激起。這的確帶來有關的幾個疑問,什麽樣的熒光染料(liào)才合適特定的激光體係。走運(yùn)的是,如(rú)今從(cóng)熒光(guāng)染料的(de)供應商那裏能夠(gòu)獲得更多(duō)的挑選了。別的也能夠(gòu)挑選運用能(néng)夠便利和快速反射多個激光束的多色主鏡。